荧光定量PCR分析仪如何实现基因的精准定量？

　　荧光定量PCR分析仪通过实时监测荧光信号变化，结合Ct值与标准曲线分析，实现基因的精准定量，其核心原理与实现步骤如下：

　　核心原理

　　在PCR扩增反应体系中加入荧光基团（如SYBRGreen染料或TaqMan探针），使荧光信号强度与扩增产物量同步变化。每完成一个PCR循环，仪器采集一次荧光信号，生成扩增曲线。通过设定荧光阈值（通常为基线信号的10倍标准差），确定扩增产物达到阈值时的循环数（Ct值）。Ct值与起始模板量呈负相关，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　实现步骤

　　标准曲线构建：使用已知浓度的标准品（如纯化质粒DNA或体外转录RNA）进行梯度稀释，以不同浓度的标准品为模板进行PCR扩增。以标准品拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。当标准品浓度范围在10²-10¹⁰拷贝数时，模板浓度与Ct值通常呈现良好的线性关系（相关系数R²>0.99），确保在此范围内可准确定量。

　　未知样本检测：将未知样本与标准品同步扩增，根据其Ct值代入标准曲线公式，计算样本中目标基因的拷贝数。例如，若标准曲线公式为y=3.1372x+38.201（y为Ct值，x为拷贝数对数），通过反向计算即可得出样本的初始模板量。

　　内参基因校正（相对定量）：在需要比较不同样本间基因表达差异时，选择管家基因（如GAPDH、β-actin）作为内参，通过计算目标基因与内参基因的Ct值差值（ΔCt），进一步采用ΔΔCt法分析相对表达量，消除样本量及反应效率差异的影响。